Роль света в жизни грибов. Часть 3.

Н.Л. Поединок,  А.М. Негрейко

Ин-т ботаники им. Н.Г. Холодного НАН Украины,
ул.Терещенковская, 2,01601 Киев, Украина
Ин-т физики НАН Украины,
просп. Науки, 46,01022 Киев, Украина

Влияние света на биосинтетическую активность макромицетов

Имеющиеся в настоящее время в литературе сведения позво­ляют говорить о возможности реализации высокоэффективных биотехнологий, базирующихся на использовании лазерного излу­чения для получения культур с высокой биологической активно­стью, повышенным внутри- и внеклеточным содержанием ценных биологических продуктов. Однако свет, как экологически чистый фактор, до сих пор не нашел практического применения в био­технологиях промышленного культивирования высших грибов, которые являются продуцентами многих лекарственных веществ и используются для лечения широкого спектра заболеваний чело­века. Как показывает анализ патентно-информационных данных, в настоящее время усилия исследователей и разработчиков направ­лены на поиск научно-технических решений, позволяющих достиг­нуть более высоких экономических показателей при получении биомассы лекарственных грибов и создание конкурентноспособ­ных фармакологических препаратов и средств. Суть решения этой задачи состоит в использовании глубинного метода выращивания лекарственных грибов.

Установлено, что свет 650 и 530 нм существенно влияет на обра­зование регуляторов роста и интенсивность ростовых процессов в технологиях глубинного культивирования мицелиальних грибов (род Aspergillus) (Горнова, 2002), а также является модификатором липидного и углеводного состава грибных спор. Изменения, вы­званные светом, имели пролонгированное действие и могут пере­даваться в следующую онтогенетическую стадию от спор к мице­лию. У мицелия, выращенного из модифицированных под дей­ствием света спор, также сохраняется способность к ускоренному росту, наблюдается изменение в углеводном и липидном составе, а следовательно, в составе и активности ферментов, которые имеют прямое отношение к метаболизму. Кроме того, изменяется и актив­ность экзоферментов, а именно целлюлозолитичного комплекса. Показано, что характер биохимических изменений в клетках гри­бов зависит как от длины волны, так и от интенсивности света, при­чем снижение интенсивности света сопровождается усилением его регуляторного влияния. Таким образом, изменяя параметры освещения, можно получить споры заданного качества.

Для Flammulina velutipes наиболее эффективным стимулято­ром биологической активности оказался свет с длиной волны 550-660 нм (Aschan-Aberg, 1960).

Мы проводили исследования по изучению влияния света на биосинтетическую активность некоторых макромицетов, отно­сящихся к разным систематическим и экологическим группам. Облучение мицелия макромицетов, которые выращивали глубин­ным способом, проводили в плоскодонной колбе и использовали в качестве инокулюма.

Полисахариды в культуральной жидкости и мицелии определя­ли известными методами (Chihara et al., 1970; Грушенко и др., 1978; Babitskaya et al., 2000; Tang, Zhong, 2002). Углеводный состав поли­сахаридов после предварительного гидролиза их 7%-ной серной кислотой на водяной бане при 100 °С в течение 5 ч определяли ме­тодом ГЖХ {Методы …, 1975; Bao et al., 2001).

Низкоинтенсивный свет видимого участка спектра может быть использован в биотехнологии культивирования G. lucidum как сти­мулятор синтеза полисахаридов (табл. 13). В наших опытах синий и красный свет значительно повышал его биосинтетическую актив­ность.

33

Облучение в исследованных нами режимах существенно влия­ло на углеводный состав экзополисахаридов как в стационарной культуре, так и при глубинном культивировании G. lucidum (табл. 14). Облучение инокулюма низкоинтенсивным лазерным светом 632,8 и 488,0 нм способствовало увеличению процентного содер­жания в экзополисахаридах ксилозы и глюкозы и значительному (в 2 раза) уменьшению маннозы в стационарной культуре гриба на жидкой среде. При глубинном культивировании G. lucidum на такой же среде облучение инокулюма в аналогичных режимах, напротив, приводит к уменьшению содержания ксилозы и глюко­зы и значительному увеличению (в 5-6 раз) маннозы. Это позволя­ет предположить, что трансформация световой энергии, которая была поглощена грибными клетками, в значительной мере опреде­ляется следующими условиями выращивания гриба.

Мы исследовали влияние низкоинтенсивного облучения раз­ной длины волны (430, 720 и 660 нм) на рост и биосинтетическую активность а с коми цетов Morchella соnica 1738 и М. esculenta 1843 во время культивирования на жидкой питательной среде ГПД в стационарных условиях (табл. 15).

35-1

В ходе эксперимента установлено позитивное влияние све­та на рост исследованных культур во время культивирования на жидкой среде в стационарных условиях. Облучение дальним красным светом (X = 720 нм) М. conica 1738 способствовало уве­личению количества массы мицелия на б%, но не влияло на коли­чество продуцирования екзополисахаридив. Облучение красным светом (X = 660 нм) стимулировало увеличение продуцирования массы мицелия на 12%, продуцирование экзополисахаридов — на 15%. Для М. esculenta 1843 при аналогичных режимах облуче­ния масса мицелия увеличивалась на 8%, количество экзополиса­харидов, сравнительно с контролем, достоверно не отличалось. При длине волны 660 нм увеличивалось продуцирование массы мицелия на 10%, а экзополисахаридов — на 7%. Облучение синим светом (X = 430 нм) не влияло на рост и биосинтетическую актив­ность исследованных культур.

Нечувствительность этой группы аскомицетов к синему свету отличает их от изученных нами базидиомицетов.

В настоящее время есть основания предполагать у меланин­содержащих грибов существование, как минимум, двух фоторе­цепторных систем: микохромной и системы с участием меланино­вого пигмента в качестве первичного фоторецептора (Жданова, Василевская, 1982). Известно, что пигменты коричневого и черного света вырабатываются клетками многих живых организмов как за­щитная реакция на излучения разного вида. Сложность структуры меланинов позволяет этим биополимерам перехватывать и рас­сеивать фотоны и электроны. В результате происходит ослабление энергии облучения и преобразование ее в энергию химических связей. Имеются сведения о положительном влиянии освещения в видимой части спектра на интенсивность пигментации разных видов микромицетов. Данные о влиянии низкоинтенсивного излу­чения на рост и синтез меланиновых пигментов макромицетами в литературе практически отсутствуют. Свет в видимой части спектра можно рассматривать как экологически чистый регулятор онто- и морфогенеза, биологической активности грибов разных эколо­гических и систематических групп. Эффект облучения зависит от ряда параметров света, однако из-за отсутствия общепризнанного механизма стимулирующего действия излучения реализация соот­ветствующих технологий базируется на эмпирических зависимо­стях, установление которых требует значительных затрат времени и материальных ресурсов.

Поэтому вполне оправдано такое планирование исследова­ний, которое, наравне с установлением основных эмпирических закономерностей стимулирующего действия низкоинтенсивного облучения на культуры грибов, позволило бы в дальнейшем обоб­щить полученные данные и определить механизм действия света различной природы на такие культуры.

Исследования влияния света на синтез меланина Inonotus obliquus проводили с использованием экспериментальных устано­вок. Эти установки обеспечивали генерацию лазерного излучения с заданными параметрами {длина волны 476; 488; 514 и 632,8 нм); а также излучения источников некогерентного света (длина волны 660,0 и 430,0 нм). Доза облучения составляла 230 мДж/см2. Облуче­ние мицелия на агаризованной среде проводили на чашках Петри. Далее стерильно вырезали диски с облученным мицелием диа­метром 5 мм, помещали их в ферметационные колбы с жидкой сре­дой (по 15 дисков) для изучения биосинтеза биомассы и меланина.

Поскольку равные виды грибов отличаются своей чувствитель­ностью к свету, при выборе режимов облучения (230 мДж/см2) мы руководствовались данными, полученными нами и другими иссле­дователями при изучении фотобиологических реакций других ви­дов грибов (Хорлин, 1975; Кару, 1986; Механизмы..1998; Поединок та iн., 2003; Duand, 1975; Poyedinok et al., 2000, 2003). Определение меланинов проводили по известным методикам (Гриффитс, 1978; Лях, 1981; Ермаков и др., 1987; Борисюк и др., 1991; Бабицкая и др., 1998, 2002, Щерба и др., 1998, 1999; Сушинская, 2005; Babitskaya, 1996).

Как правило, при оценке биохимического воздействия света учитывают энергию светового кванта, интенсивность светового потока (количество квантов света на единицу площади в единицу времени), дозу, спектральный состав света. С этой точки зрения ла­зерные источники способны обеспечить, даже при низкой и сред­ней интенсивности, спектральную густоту (энергию на одиночный частотный интервал), которая недоступна тепловым источникам. Благодаря хорошей пространственной когерентности лазерный пучок может быть сильно сфокусированным и создавать большую интенсивность света. Для лазерного света легко обеспечить задан­ную поляризацию (линейную, круговую, эллипсоидную).

Поэтому, соглашаясь с тем, что когерентный и некогерентный свет одинаковой длины волны и дозы обладает одинаковым воз­действием на биологические объекты (Кару, 1986, 2008), с этими уникальными характеристиками лазерного света можно связать некоторые специфичные механизмы воздействия света на веще­ство, в т.ч. числе на биологические объекты. Так, при невысоких интенсивностях света могут иметь место нелинейно-оптические эффекты: насыщение поглощения, двух- и многофотонное погло­щение, фотоионизация молекул и пр. Спекл-картина (зернистость, неравномерное распределение интенсивности в лазерном пучке, обусловленное интерференцией рассеянного поверхностью све­та) и градиенты распределения интенсивности объясняют био­логическую активность когерентного лазерного излучения через механизм пространственной неоднородности лазерного поля (Ме­ханизмы …,1998).

Низкоинтенсивный свет в видимой части спектра может быть использован в биотехнологии глубинного культивирования І. obliquus не только как стимулятор роста, но и как стимулятор син­теза меланина (рис. 11). Можно отметить ту же тенденцию — облуче­ние лазерным светом значительно в большей степени индуцирует синтез меланина, чем облучение неполяризованным светом. Облу­чение гриба синим светом (476 и 488 нм) увеличивало количество синтезируемого грибом меланина на 43-54% (рис. 11,12).

38-1

Изучение динамики накопления меланина показало, что его синтез достигает стационарной фазы после облучения лазерным светом в диапазо­не 476-488 нм на 9 сут, тогда как в контроле на 12 сут ферментации перехода в стационарную фазу не наблюдалось (рис. 12).

39-1

Использование на практике адаптационные возможности ме­ланинсодержащего гриба /. obliquus, его защитные возможности, проявляющиеся в увеличении синтеза меланина в результате излу­чения различной природы, позволит значительно интенсифициро­вать биотехнологические этапы получения биомассы и меланина этого ценного лекарственного гриба и увеличит выход конечного продукта.

Облучение низкоинтенсивным лазерным светом с длинной вол­ны 632,8 нм в непрерывном и импульсном режиме позволило уве­личить антимикробную активность Pleurotus ostreatus в глубинной культуре (экстракт мицелия и культуральная жидкость) по отноше­нию к Micrococcus luteus, Staphyloccocus aureus и Bacillus mycoides на 10-20% (табл. 16).

39-2

Влияние света на микроморфологию макромицетов

Изучение облученных в вышеуказанных нами режимах макро­мицетов не показало каких либо изменений их микроморфологии по сравнению с контролем. На наш взгляд, облучение красным и синим светом стимулировало формирование у Ganoderma lucidum большого количества кораллоидних гиф (рис. 13,14).

40-1

В главе представлены результаты исследований действия лазерного излучения на прорастание базидиоспор Hericium erinaceus и рост монокариотических изолятов, а также возмож­ности стимуляции этих процессов для получения большого коли­чества монокариотических изолятов для селекционной работы. Лазерное излучение в дозах 45-230 мДж/см2 активизировало про­цесс прорастания спор у штамма Не 13 приблизительно в 10 раз, у штамма 1756 — в 100, у штамма 993 — в 105 раз. Причем действие лазера было тем эффективней, чем ниже был начальный процент прорастания спор. Отмечено сокращение времени прорастания облученных спор и формирования воздушного мицелия. Такая обработка позволяет втрое увеличить скорость роста моноспо- ровых культур, что имеет большое значение в селекционной ра­боте.

Проведенные исследования позволили определить влияние низкоинтенсивного света, полученного из различных источников, на линейный рост и накопление биомассы вегетативного мице­лия различными видами макромицетов. Фотобиологический эф­фект после облучения мицелия более четко выражен при росте грибов на жидкой среде. Облучение посевного мицелия синим и красным светом приводит к его активизации и увеличению ско­рости роста культур, сокращению сроков ферментации при глу­бинном культивировании.

Установлено, что облучение лазерным светом в красном и си­нем диапазонах в большей степени способствует росту и нако­плению биомассы гриба, чем облучение некогерентным светом в том же диапазоне длин волн.

Изучено влияние облучения на колонизацию субстратов мицелием и плодоношение макромицетов. Установлено, что об­лучение способствует сокращению периода, предшествующего плодоношению, и сроков плодоношения. При этом происходит значительное увеличение урожайности плодовых тел. Облучение посевного мицелия способствует улучшению качества плодовых тел (на 18% увеличивается количество плодовых тел первого сорта).

Низкоинтенсивный свет в видимой части спектра может быть использован в биотехнологии глубинного культивирования не только как стимулятор роста, но и синтеза биологически актив­ных веществ (полисахаридов, меланинов).

Дальнейшее изучение фотобиологических реакций грибов, накопление экспериментального материала по вопросам стиму­лирующего действия низкоинтенсивного облучения разной при­роды на их биосинтетическую активность приблизит нас к пони­манию фундаментальных механизмов действия света на грибной организм.