Роль света в жизни грибов. Часть 1.

Н.Л. Поединок,  А.М. Негрейко

Ин-т ботаники им. Н.Г. Холодного НАН Украины,
ул.Терещенковская, 2,01601 Киев, Украина
Ин-т физики НАН Украины,
просп. Науки, 46,01022 Киев, Украина

Свет является одним из важнейших физических факторов для живых организмов на Земле. Для большинства макромицетов он служит морфогенетическим фактором, хотя они и не относятся к фототрофным организмам. В целом, значение света для развития грибов в природных условиях практически не изучено. В отличие от этого данный физический фактор хорошо изучен в лаборатор­ных условиях. Влиянию света на рост и развитие шляпочных гри­бов посвящено большое количество исследований (Поединок та iH., 2003, 2006; Gottlieb, 1950; Reijnders, 1963 ; Gressel, 1979, 1983; Manachere, Bastoull-Descollonges, 1980; Fries, 1983, 1987; Горовой, 1989; Deploey, 1990,1995; Poyedinoket al., 2000, 2001, 2003, 2005).

Механизмы фоторецепции у грибов

Свет — ключевой фактор развития фотосинтезирующих орга­низмов, но его можно разглядывать и как важную составляющую окружающей среды для нефотосинтезирующих. Чувствительность к свету проявляется для всех классов живых существ, от наипро­стейших до человека. Световыми сенсорами являются хромопро­теины — низкомолекулярные соединения, которые поглощают свет в определенных участках спектра и инициируют реакции белков. У грибов можно выделить три светочувствительные системы на молекулярном уровне (Purschwitz et al., 2006). Чувствительность к синему свету обеспечивается фоторецептором на основе флавина, который сам действует как передающий источник. Чувствитель­ность к красному свету реализуется с помощью фитохрома, моле­кулы, которая до недавнего времени считалась присущей только растениям. Недавно открыты опсиновые системы на основе ретиналя, биологические функции которых еще требуют изучения. Не­обходимы дальнейшие фундаментальные исследования, которые должны установить следующие компоненты сигнальных каскадов, идентифицировать светорегулирующие гены и установить воз­можные межсистемные связи между различными светорегулирую­щими системами. Грибы, одни из древнейших организмов нашей планеты, имеют фоторегуляторную систему микохром, оптические свойства кото­рой отображает наличие наибольшего скачка в спектре Солнца в области 400 нм. Отличительной чертой этой системы является за­висимость ряда стадий морфогенеза и плодообразования у грибов от длительности и интенсивности синего и ультрафиолетового све­та (Крицкий, 1976; Kumagai 1980).

Еще в 1950 г. Х.Е. Хавке разделила грибы по отношению к све­ту на 4 группы (Hawker, 1950). Вопросы фоторецепции световой энергии в мицелии и механизмы превращений, которые происхо­дят после поглощения света, довольно сложные и слабо изучены. Углубленное изучение светового воздействия на грибы привело к открытию микохромных систем у представителей разных таксо­номических групп: аскомицетов, базидиомицетов, дискомицетов. Преобладающее число грибов, у которых установлено наличие микохромных систем, имеет каротиноидные и меланиновые пиг­менты. Указанные пигменты тесно связаны с клеточной мембра­ной и способны взаимоокисляться и восстанавливаться (Жданова, Василевская, 1982). Молекулярную основу энергетического мета­болизма грибов составляют цепи электронного транспорта (ЦЭТ), компонентами которых являются флавины, цитохромы и хиноны. Свет, который непосредственно влияет на компоненты ЦЭТ, может поглощаться этими компонентами и изменять их активность. Свет может активизировать непосредственно компоненты ЦЭТ, кото­рые стоят в узких местах энергетического метаболизма, удобных для процессов регуляции. Поэтому подсвечивание грибов светом в диапазоне от 400 нм приводит к активации разных спектральных форм молекул-переносчиков электронов, что нарушает баланс между временем жизни этих форм и может привести к временно­му рассогласованию многостадийных биохимических реакций (Ка­невский, Сиваш, 1988; Кару, 2008). У таких видов макромицетов, как Polyporus arcularius, Lentinus edodes, Agaricus bisporus, идентифици­рованы фоторегулируемые гены, контролирующие ферментатив­ную активность, в частности синтез тирозиназы.

Свет в видимой части спектра уже используют в технологиях глубинного культивирования мицелиальных грибов как перспек­тивнейший природный экологически чистый регуляторный фак­тор (Горнова, 2002). Инфракрасные лучи в определенных дозах вызывают усиление роста культур лекарственных грибов Coriolus vaporarius и Serpula lacrimans. Отсутствие или наличие светового воздействия в период вегетативного роста мицелия сказывается на характере последующего плодоношения.

В настоящее время в биотехнологии, одной из наиболее ди­намично развивающейся области человеческой деятельности, широкое применение нашли лазерные технологии. Возможность целенаправленного воздействия лазера на внутриклеточные про­цессы и регулирование процессов биосинтеза обусловлены селек­тивным воздействием монохроматического света на электроны фоточувствительных структур, фоторецепторы и внутриклеточные процессы у микроорганизмов. Преимуществом лазерного излуче­ния является возможность создания высокой спектральной ярко­сти, не достигаемой при использовании обычных некогерентных источников света. Такие свойства позволяют говорить о возможно­сти реализации высокоэффективных биотехнологий для получе­ния культур с высокой биологической активностью, повышенным внутри- и внеклеточным содержанием ценных биологических про­дуктов. В тоже время, практическое использование монохромати­ческого света в биотехнологических процессах ограничено из-за отсутствия сведений, четко определяющих механизмы действия света, эффективные длины волн и режимов облучения. Не все из­вестные положения о биомеханизме действия низкоинтенсивного лазерного излучения являются бесспорными, некоторые из них — лишь теоретические гипотезы и окончательно не подтвержденные концепции.

В настоящее время преобладает эмпирический подход к раз­работке методов светового воздействия на грибы. Это связано с отставанием теоретического и экспериментального обоснования механизма взаимодействия низкоинтенсивного излучения с гриб­ным организмом. Тем не менее, практическое использование света в биотехнологических процессах возможно даже без общеприня­тых выводов о механизмах его действия (естественно, выяснение механизмов многократно усилило бы эффективность), но при условии тщательного исследования спектра действия наиболее эффек­тивных длин волн, режимов облучения (интенсивности, дозы, гео­метрии, поляризации, когерентности и т.п.).

Одним из спорных остается вопрос о специфичности лазерно­го излучения низкой интенсивности на биологические объекты. Одна группа исследователей (Механизмы …. 1998) считает, что когерентность лазерного излучения не является определяющей при воздействии света на живой организм, другие исследователи обосновали биологическую активность когерентного лазерного излучения через механизм пространственной неоднородности ла­зерного поля (Лобко и др., 1985). Поэтому есть достаточно весомые основания для исследования специфических механизмов действия когерентного света на биологические объекты.

Эффект стимулирования роста и биологической активности под действием низкоинтенсивного лазерного излучения (гелий- неоновый лазер) обнаружен у некоторых бактерий и дрожжей, а также у многих видов высших растений и животных (Karu et al., 1984). Сведения о действии такого рода излучения на высшие гри­бы крайне недостаточны.

Влияние света на прорастание спор

Одним из наиболее актуальных направлений в современной микологии и биотехнологии является воспроизводство в культу­ре различных видов макромицетов, сохранение их в коллекциях и селекция высокопродуктивных штаммов с заданными характе­ристиками с помощью генетических методов. Один из таких мето­дов — скрещивание моноспоровых изолятов и получение дикарионов с новыми свойствами. Монокариотичные культуры, выделен­ные из одной споры, используют при изучении таксономии, гене­тики (Бухало, 1988), половой дифференциации и других вопросов у высших базидиомицетов. Многие исследователи уделяют вни­мание получению культур из базидиоспор (Сухомлин, 1998; Allen, 1965; Macko, Staples, 1973; Ginns, 1985,1991; Peterson, 1995; Kropp, 1997; Klein et al., 1997; Al-Mughrabi, 1998; Yuko Ota, 1998; Zervakis, 1998) и сталкиваются с трудностями при их проращивании в ла­бораторных условиях (Бисько и др., 1983; Kreisel at al., 1987). По­этому вопрос активации их прорастания остается актуальным и сегодня. Описаны способы активации прорастания базидиоспор высших базидиомицетов в период покоя тепловой обработкой, добавками в среду активированного угля и/или дрожжей (много­численные эктомикоризные грибы, в частности гименомицеты и гастеромицеты).

Однако эти методы эффективны только для базидиоспор, находящихся в состоянии покоя, в частности видов р. Agaricus, и выявились неэффективными для прорастания базидиоспор представителей родов Hericium, Hydrocybe, Camarophyllus.

Кроме того, получение базидиоспор из плодовых тел у многих базидиальних грибов, и в частности у Hericium erinaceus, как в лабо­раторных, так и производственных условиях, является процессом достаточно длительным и трудоемким. Установлено, что способ­ность к прорастанию спор у И. erinaceus очень низкая (Поединок та iн., 2001, Поединок, 2002) и является штаммоспецифическим признаком и колеблется от 10-4 до 10  (табл. 1).

5-1

08-1

Для проведения же селекционной работы необходимо получить большое количество моноспоровых культур разных штаммов. Как отмечалось выше, на рост, плодоношение, спороношение грибов и прорастание спор свет влияет. Характер его влияния зави­сит от вида гриба и природы света. В зависимости от спектрально­го состава светового пучка происходит стимуляция или угнетение определенной фазы развития грибного организма или изменяются его физиолого-биохимические показатели (Жданова, Василевская, 1982).

В настоящее время в биологии, биотехнологии, медицине ис­пользуют низкоинтенсивное лазерное излучение для стимуляции различных биологических процессов. Доказано, что фоточувстви­тельность к низкоинтенсивному монохроматическому свету разных клеток (прокариот, примитивных и высших эукариот) имеет универсальный характер, который предполагает существование одного и того же молекулярного механизма с первичными фотоакцептора­ми, которые представляют собой ряд связанных между собой моле­кул (Кару и др., 1985,1999; Кару, 1986,2008). Первичные фотоакцеп­торы являются компонентами окислительно-восстановительной цепи. Считается, что эта окислительно-восстановительная цепь — дыхательная. Экспериментальные данные свидетельствуют о том, что относительно маленькие дозы (102-103 Дж/м2) и недлительное облучение вызывают макроэффект, который долго сохраняется. При этом наблюдается стимуляция синтеза АТФ и фосфорилирова­ния в митохондриях животных и растительных клеток, увеличива­ется синтез белка (Pastore et al., 1996; Vacca et al., 1996; Gagliardi et al., 1997; Greco etal., 1999).

Нами исследовано действие лазерного излучения на прорас­тание базидиоспор Н. erinaceus и рост монокариотических изолятов, а также возможности стимуляции этих процессов для по­лучения большого количества монокариотических изолятов для селекционной работы.

Для исследования были отобраны базидиоспоры трех штам­мов Н. erinaceus, которые существенно отличались способностью спор к прорастанию (процент прорастания штамма 993 состав­лял 1,4-1О’4, 1756 — 1,3-10′2 и Не13 — 9,6%). Споровые отпечатки помещали в чашки Петри и подвергали действию лазерного об­лучения в красной части спектра (лазер ЛГН-215, длина волны 632,8 нм) в дозах 45, 230 и 650 мДж/см2. Из облученных базиди­оспор готовили водные суспензии, под микроскопом в камере Горяева для каждого штамма определяли концентрацию спор и высевали на поверхность голодного агара, равномерно рас­пределяя суспензию. Инкубировали в темноте при температуре 26 °С. Прорастание спор контролировали под микроскопом ежедневно. Отдельно лежащие проросшие споры изолирова­ли в пробирки с сусло-агаром. Сформированные мицелиальные структуры анализировали на наличие пряжек и кариотичность. Ядра окрашивали по методу Гимза (Методы …, 1982).

Полученные нами результаты показали (табл. 2), что лазерное излучение в дозах 45-230 мДж/см2 активизирует процесс прорас­тания спор у штамма Не13 приблизительно в 10 раз, у штамма 1756 — в 100, у 993 — в 105 раз. Причем действие лазера тем эффек­тивней, чем ниже начальный процент прорастания спор.

Такую зависимость наблюдали и другие исследователи при сти­муляции роста микроорганизмов путем лазерного облучения (Каш et al., 1984). Была выявлена сезонность в ростостимулирующем эф­фекте. То есть, фоторегуляция в позитивном смысле слова (стимуля­ция) может проходить только тогда, когда пролиферативная актив­ность клеток (скорость роста культуры) не является максимальной. Летом, когда рост культуры ускорялся, эффект фотостимуляции роста практически не наблюдали, зимой он был максимальным, а весной и осенью — промежуточным.

Кроме увеличения процента прорастания мы выявили сокра­щение времени прорастания облученных спор и формирования воздушного мицелия на агаризованой среде по сравнению с на­чальными показателями у исследованных штаммов (табл. 3).

08-2

У 50 моноспоровых изолятов штамма Не13, полученных с бази- диоспор и облученных лазерным светом, изучали динамику роста. Полученные результаты (рис. 1) дают основание утверждать, что такая обработка позволяет втрое увеличить скорость роста моно­споровых культур, что имеет большое значение в селекционной работе.

Анализируя полученные результаты можно допустить, что об­лучение низкоинтенсивным лазерным светом приводит к пере­стройке метаболизма клеток гриба и выступает его регулятором. Известно, что скорость прохождения клеточного цикла зависит от многих факторов (ионного состава питательной среды, присут­ствия гормонов, факторов роста и пр.). Возможно, монохроматиче­ский свет, к которому грибы не адаптированы (в отличие от солнеч­ного, к которому организмы адаптированы в процессе эволюции), выступает как фактор окружающей среды, способный влиять на активность грибной клетки.

Влияние света на развитие вегетативного мицелия

В литературе нет данных, которые свидетельствовали бы о не­обходимости света для развития вегетативного мицелия до начала плодообразования. Однако отмечено, что световое воздействие влияет на морфологию культур. Отсутствие или наличие светового фактора в период роста вегетативного роста мицелия отражается на характере дальнейшего плодоношения.

Проводились исследования по изучению возможности пере­дачи светового воздействия по мицелию (Madelin, 1956; Robbins, Hervey, 1960). Разные авторы, исследуя разные грибы, получили противоречивые результаты. Одни исследователи утверждали, что действие света проявляется только на освещенных участках и ни­какой передачи по мицелию не происходит. Другие показали, что передача светового воздействия по мицелию может иметь место.

Относительно времени проявления фоточувствительности были высказаны и проверены две гипотезы: 1) фотоиндукция проявляется, когда мицелий становится физиологически зрелым; 2) фотоиндукция начинается, когда ресурсы пространства и пита­ния исчерпаны (Lu, 1965). В результате проведенных исследований было подтверждено другое предположение и дано следующее объяснение — при исчерпании ресурсов питания и пространства мицелиальный рост замедляется и происходит вынужденная пере­стройка метаболизма. Это приводит к образованию в клетках ми­целия гипотетического фоторецепторного предшественника, спо­собного поглощать световую энергию. При поглощении световой энергии образуются специфические вещества, стимулирующие об­разование плодовых тел.

Проведенные нами исследования позволили определить влия­ние низкоинтенсивного света, полученного из различных источни­ков, на линейный рост и накопление биомассы вегетативного ми­целия различными видами макромицетов.

Двухсуточный вегетативный мицелий грибов: штаммы 353 Lentinus edodes, 431 Pleurotus ostereatus и 969 Hericium erinaceus об­лучали на сусло-агаре, используя He-Ne лазер, в красной области (Х]=632,8 мкм) и аргоновый лазер в зеленой (Х^= 514,5 нм) обла­сти спектра. Время экспозиции t,= 8 мин и t2= 18 мин, мощность W, = 45 мВт и W, = 25 мВт соответственно. Мы исходили из пред­положения, что возможный механизм, ответственный за биологи­ческую активность света, инициируется поглощением отдельного фотона лазерного излучения с возбуждением молекул биологи­ческой системы. Исходя из этого, экспозиция выбиралась такой, чтобы число падающих фотонов было практически одинаковым при обработке мицелия красным и зеленым светом. Облученный на агаризованной среде мицелий и контроль инкубировали далее в тех же условиях в полной темноте в течение 13 суток, каждые два дня контролируя показатели роста (диаметр колонии, высо­та и плотность мицелия). Ростовой коэффициент определяли по формуле РК= hdg/t (d — диаметр колонии; h — высота, мм, g — плот­ность мицелия, баллы; t — возраст, сут (Бухало, 1988).

12-112-2

На сусло-агаре среднесуточный прирост мицелия гриба Lentinus edodes, облученного в разных спектрах, достоверно не отличался от контроля (табл. 4). Однако за счет формирования более высоко­го и плотного мицелия при облучении в опыте ростовой коэффици­ент был в 2-3 раза выше. Для Р. ostreatus и Н. erinaceus отмечалось увеличение скорости линейного роста и ростового коэффициента более чем в 2-3 раза.

Через 120-130 дней инкубирования L. edodes на агаризованной среде на мицелии, подвергавшемуся лазерному излучению, начи­нали формироваться примордии.

13-1

В контроле в течение 160 сут ис­следований формирования плодовых тел не наблюдалось. После облучения красным светом образование примордиев начиналось на 7-10 дней раньше, чем после облучения зеленым светом, и ко­личество их было значительно большим (рис. 2).

Работы по определению наиболее активных участков электро­магнитного излучения на высшие базидиальные грибы были нача­ты еще в прошлом столетии (Brefeld, 1877). Было установлено, что разные виды грибов могут отличаться своими морфогенетически­ми реакциями на разные участки спектра (Schenk, 1919).

Нами сделаны первые шаги по изучению влияния низкоин­тенсивного излучения разной длины волны, полученного из раз­ных источников, на рост и накопление биомассы такими широко известными лекарственными грибами, как Ganoderma lucidum и Inonotus obliquus.

Продолжение следует…